產品名稱：
轉讓重組葡激酶項目(Sak)全套技術
產品類別：未知類型
信息內容：重組葡激酶項目(Sak)簡介
正式品名： 重組葡激酶
化學名： 重組金葡菌纖溶酶原激活劑
外文名： Recombinant Staphylokinase (r-Sak)
漢語拼音名： Chongzupujimei
天然的葡激酶是由金葡菌發酵產生的。我們通過重組DNA技術，由金葡菌染色體DNA中獲得了克隆化的葡激酶結構基因，在大腸桿菌系統中實現了高效表達。表達產物—重組葡激酶（r-Sak）具有纖溶酶原激活作用，經發酵、分離純化獲得了單一組分的小分子Sak，其具有與成熟Sak相同的藥用價值。
選題的目的與依據
心腦血管病是當今危害人類健康與生命的主要疾患之一。本項目的目的在于研制一種新型的溶解血栓劑藥，用于血栓病的預防和治療。臨床上常用的溶栓劑均是直接（如：尿激酶 UK和t-PA）或間接（如：鏈激酶 SK）纖溶酶原激活劑。這些纖溶酶原激活劑都有一些缺點，如：t-PA穩定性差，SK由于為非人原性蛋白，誘生抗體; 較為突出的問題：是作用缺乏選擇性，易引起出血并發癥，尤其是顱內出血。因此，不斷開發新的更好的溶栓藥物是當務之急。葡激酶可望成為一種快速、高效、新型的溶栓劑。
我們自己篩選到一株產葡激酶的金葡菌，以該菌染色體DNA為模板，通過PCR擴增和DNA重組技術，獲得了Sak的結構基因，實現了高效表達，構建了一株高產菌，為Sak的產業化打下了基礎。
國外有關該產品的研究現狀與生產及臨床使用情況：
Lack于1948年報道了金葡菌產生的一種非酶蛋白，能夠激活纖溶酶原轉化為纖溶酶。60年代前僅就其體外纖溶性作了初步研究。Lewis等和Kanae分別于1964年和1986年用狗觀察了葡激酶的溶栓情況。過去研究用的葡激酶來自金葡菌發酵，產率低，數量有限又有內毒素的污染，影響實驗結果在所難免，使得多年來葡激酶的研究停滯不前。只有DNA重組技術的引入，高產工程菌的構建，最新生化技術的應用，才有可能提供大量的高純度的重組葡激酶（r-Sak）。因此，九十年代以來葡激酶的研究才有了長足的發展。日本、德國和比利時等國都在積極開展葡激酶的研究。進行了基因克隆、酶的結構與性質、酶作用機制與纖維蛋白專一性等項工作，并從體外實驗、動物血栓模型、臨床實驗、免疫原性等方面與鏈激酶（SK）進行了比較研究。
葡激酶的結構與生產
國外已分別由金葡菌溶原性轉換噬菌體和染色體DNA獲得了克隆化的基因。分別命名為Sak42D和SakSTAR，在大腸桿菌和枯草桿菌中都實現了高效表達。測定了基因的核苷酸序列，確定了酶的氨基酸序列。成熟的葡激酶（Sak-M）由136個氨基酸組成，同時發現NH2末端失去6個和10個氨基酸的Sak-D6和Sak-D10，同樣具有生物活性，甚至Sak-D10比Sak-M具有較高的比活。有趣的是SakSTAR比Sak42D具有較好的熱穩定性。高產工程菌可獲得約200mg/L葡激酶。
r-Sak作用機制及其纖維蛋白專一性
葡激酶(S)像鏈激酶一樣為非酶蛋白，與纖溶酶原(P)結合形成無活性的纖溶酶原—葡激酶復合物(P×S)。然后，轉化成有活性的纖溶酶復合物(Pi×S)以此催化另一些纖溶酶原分子轉化為纖溶酶(Pi)。如圖1：
Pi + S
P + S P×S Pi×S
P Pi
圖1：在緩沖液中
通常，Pi×S能促進P×S向Pi×S轉化，更有效地將P轉化為Pi。
如圖2所示，P×S與P×SK截然不同。在無血纖維蛋白的血漿中,a2-纖溶酶抑制劑（a2-Ap）與Pi×S中的Pi結合導致無活性的Pi×a2-Ap（PAp）復合物形成。從而抑制S對P的活化，避免了過度纖溶酶原活化而導致的“溶血狀態”（“Lytic state”）。
Pi + S + Ap PiAp + S
P + S P×S Pi×S
圖2：在無血纖維蛋白的血漿中
在有血纖維蛋白的血漿中，如圖3所示。P×S通過其P中的賴氨酸位點與纖維蛋白的結合，促進P的活化，血纖維蛋白的作用在于：大大抑制a2-Ap對血塊上Pi×S復合物的結合，同時增強活性Pi×S復合物的產生，從而促進
P×S Pi×S轉化和S由Pi×S解離出來，并參與另一輪循環。顯然P的活化是在血塊表面上進行的。
Pi +S +Ap PiAp + S
Fibrin
P + S P×S Pi×S +Ap PiAp + S
P Pi
圖3：在有血纖維蛋白的血漿中
根據以上分析，可以繪制出一個有關Sak激活作用的纖維蛋白專一性的作用機制圖。如圖4所示，非纖維蛋白專一性的激活劑，如SK和雙鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑（tcu—PA），不論有無纖維蛋白存在的情況下，均可激活纖溶酶原，因而出現a2-抗纖溶酶抑制劑大量消耗并產生過量的纖溶酶，導致纖維蛋白原、因子Ⅴ和因子Ⅷ等血漿蛋白的降解造成“溶血狀態”。Sak與SK不同，在無血纖維蛋白的情況下，由于血漿中少量的纖溶酶與a2-antiplasmin結合，不產生或很少產生Pi×S復合物，因而沒有出現纖溶酶的激活作用。在有血纖維蛋白存在的情況下，選擇性地激活血纖維蛋白表面纖溶酶原，在十分有效地降解血栓的同時，正常血液循環中的血漿蛋白基本上不受傷害，從而避免了“溶血狀態”。
Fibrinogen
Factor Ⅴ Degradation products
Factor Ⅷ
a2-antiplasmin
Plasminogen Plasmin
Staphylokinase
Plasminogen Plasmin
圖4：Sak激活纖溶酶原的纖維蛋白專一性
r-Sak與r-SK的比較研究
1. 基礎性實驗
以兔作實驗，比較幾種常用的纖溶酶原激活劑，給藥120分鐘后的結果。如表1：
表1：各種溶栓劑效果比較
溶掉50%血纖維蛋白時酶濃度（mg/ml） 比值（R/Sak）
r-Sak 1.8 1.0
r-SK 22.1 12.3
t-PA 2.1 1.2
u-PA 4.7 2.6
另一組實驗給兔用藥360分鐘后的結果如表2：
表2：
溶栓50%時的酶濃度（mg/Kg） 比值 (用藥量) 血液中的纖溶酶原濃度
r-Sak 150 1.0 正常
t-PA 500 3.3 正常
以125I人血塊在人血漿中為材料，對r-Sak和r-SK溶解血纖維蛋白能力和纖維蛋白原降解情況。結果如表3：
表3：
溶解50%血塊所需酶量（nmol/L） 纖維蛋白原降解率（%）
r-Sak 17.0 5.0
r-SK 68.0 90.0
r-SK/r-Sak 4.0 18.0
在沒有血纖維蛋白塊存在的條件下，在2小時內人血漿纖維蛋白原降解50%時，所需的酶量如表4：
表4：
酶量（nmol/L） 比值
Sak 790.0 180
SK 4.4 1
急毒初步觀察，10只小白鼠（25g/只）按4mg/Kg r-Sak靜注，8天內沒有發生任何急性反應，體重未減少。
無論動物體內實驗還是人血漿體外實驗都一致表明：除r-Sak和t-PA外，所有的纖溶酶原激活劑，在溶解血塊的適當濃度條件下，都使循環中的血漿纖維蛋白原水平明顯降低。r-Sak基本上不影響纖維蛋白原和a2—纖溶酶原抑制劑的正常水平。從溶栓能力上看，依次為r-Sak>t-PA>u-PA>r-SK，r-Sak溶栓能力最強。說明r-Sak是一種安全、高效的溶栓劑。
1.動物種屬的差異
以不同種動物進一步比較了r-Sak和r-SK的纖溶性。對于狒狒、狗、大鼠、田鼠等動物自體固有的血塊體外實驗表明，r-SK似乎是一種較弱的纖溶酶原激活因子，相反，r-Sak除大鼠外，對溶解其他動物血塊非常有效。對于溶解狒狒、狗、兔、和田鼠血漿中血塊的效果與人血系統相當。然而，r-Sak對狗的系統似乎過于敏感。這可用以解釋60年代和80年代初期在以狗的實驗中為什么會出現致死性的出血現象。
在人的血漿中對富含血小板和血小板較少的血塊，r-Sak均具有良好的纖溶活性。然而，r-SK對富含血小板的血塊作用甚差。與非纖維蛋白專一性相反，Sak不太作用于循環中的纖溶酶原，這一點在臨床上具有十分重要的意義。在缺血過程中，由于血小板聚集而造成的心腦動脈血栓。
2. 動物血栓模型
以不同種動物血栓模型比較了r-Sak和r-SK溶栓效果。田鼠肺栓塞實驗，當用富含血小板血漿血塊和機械壓縮血漿血塊模型（compressed plasma clots），r-Sak比r-SK溶栓能力分別高5倍和2倍。對兔、狒狒頸靜脈血栓，二者溶栓能力相當。而對于狗大腿靜脈血栓模型r-Sak比r-SK高5倍。與r-SK相比，在狗、狒狒的富含血小板股動脈雙線結扎移位造成的血栓模型（Femoral arterial eversion graft thrombosis mode）方面，r-Sak能更可靠地誘導血管再通（recanalization）。
以狗、狒狒體外循環血栓模型，在r-Sak和r-SK的免疫原性方面進行了比較。這兩種動物血漿本底(baseline)均含有測得出的SK中和活性。但是，沒有測出Sak的中和活性。每周給狗用藥，Sak比SK產生抗體要晚。每周給狒狒用藥，SK顯著地增加了中和抗體，并伴隨有嚴重的低血壓，溶栓能力逐漸降低。但是，r-Sak每周給藥5次，4只狒狒中有1只產生抗體，仍保持了原有的溶栓能力，也未出現低血壓和過敏反應。動物實驗表明：與SK比起來，Sak是一種弱免疫原性、弱過敏性、對富含血小板的血栓溶栓性高的纖溶酶原激活劑。
3. 臨床實驗
r-Sak在體外實驗和動物模型上均獲得了令人鼓舞的結果，激勵著人們開展了臨床研究。比利時由38位醫學博士、7個醫療中心組成了r-Sak臨床試驗小組，開展了r-Sak臨床研究。1993年以來，入試者達100多人。
給10位擴張性心梗（evolving myocardial infarction）患者，30分鐘靜脈注射10mg r-Sak，合用肝素和阿司匹林，10人中的9人在用藥后40分鐘內冠狀動脈再通：8人為TIMI 3（完全灌注，complete perfusion），1人為TIMI 2（部分灌注，partial perfusion）。纖維蛋白原和a2—抗纖溶酶抑制劑保持正常水平。另有5人急性心肌栓塞患者，靜注r-Sak 10mg，達到TIMI 3級所需時間：10分鐘2人；15分鐘1人；20分鐘2人。1993年10月15日至1994年10月20日在臨床上開展了大面積試驗，入試者達100人，r-Sak組48人，其中25人30分鐘靜注r-Sak 10mg；23人30分鐘靜注20mg。r-tPA組52人。用藥量為90-100mg，所有心梗患者同時用肝素和阿斯匹林。90分鐘的實驗結果，溶栓達到TIMI 3級：r-Sak組為62%；r-tPA組為58%。危險率(risk ratio) 為1.1; 95%血漿清除率為0.76-1.5。r-Sak 10 mg /人劑量組達到TIMI 3級者50%，危險率0.86；95%血漿清除率相對r-tPA為0.54-1.4。r-Sak 20 mg /人劑量組TIMI3為74%；危險率1.3；95%血漿清除率為0.90-1.18。90分鐘，纖維蛋白原r-Sak組為基礎水平的118±47%（mean±SD），r-tPA為68±42%（p<0.0005）。r-Sak治療組與