蠟樣芽胞桿菌檢驗

中國虎網 2011/12/2 0:00:00 來源: 未知

蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）是一種需氧性，能形成芽胞的革蘭氏陽性桿菌。本菌在自然界分布較廣，通常存在于土壤、蔬菜以及許多生的和加工食品中。蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒常發生在食品供應前的加工和儲存過程中未進行冷藏，使該菌在食品中得以增殖。食入含大量蠟樣芽胞桿菌每克食品達到106或以上時，可引起食物中毒。
蠟樣芽胞桿菌食物中毒涉及食品較多，包括剩米飯、甜點心、乳肉類食品、豆制品、蔬菜等。
蠟樣芽胞桿菌所致食物中毒有兩種類型。一種是以惡心、嘔吐病狀為主；另一種是以腹疼、腹瀉癥狀為主。前者潛伏期較短，為1~5h；后者潛伏期較長，為8~24h。

第一節蠟樣芽胞桿菌標準檢驗方法

一、檢驗方法
（一）菌數測定
以無菌操作將檢樣25g（或25ml）按GB 4789.2《食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定》用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液做成10-1~10-5的稀釋液。取各稀釋液0.1ml，接種在兩個選擇性培養基——甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂平板上，用L形棒涂布于整個表面，置36±1℃培養12~20h后，選取菌落數在30個左右者進行計數。蠟樣芽胞桿菌在此培養基上生成的菌落為紅色（表示不發酵甘露醇），周圍有粉紅色的暈（表示產生卵磷脂酶）。計算后，從中挑取5個這樣的菌落伏證實試驗。根據證實為蠟樣芽胞桿菌的菌落數，計算出該平板內的蠟樣芽胞桿菌數，然后乘其稀釋倍數，即得每克或毫升樣品中所含蠟樣芽胞桿菌數。例如，將固體檢樣的10-4稀釋液0.1ml涂布于甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂平板上，生成的可穎菌落為25個，取5個鑒定，證實為4個，則1g檢樣中蠟樣芽胞桿菌為：
25×4/5×104×10=2×106
（二）分離培養
將檢樣或其稀釋液劃線分離培養于選擇性培養基（MYP）上，置37℃培養12-20h，挑取可穎為蠟樣芽胞桿菌的菌落，接種于肉湯和營養瓊脂做成純培養，然后做證實試驗。
（三）證實試驗
1. 形態觀察。本菌為革蘭氏陽性大桿菌，寬度在1μm或1μm以上，芽胞呈卵圓形，不突出菌體，多位菌體中央或稍偏于一端。
2. 培養特性。本菌在肉湯中生長混濁，常微有菌膜或壁環，振搖易乳化；在普通瓊脂平板上生成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣不齊。
3. 生化性狀。本菌有動力；能產生卵磷脂酶和酪蛋白酶；過氧化氫酶試驗陽性；溶血不發酵甘露和木糖；常能液化明膠和使硝酸鹽還原；在厭氧條件下能發酵葡萄糖。
（四）生化分型
蠟樣芽胞桿菌可根據對檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、淀粉水解、V-P反應、明膠液化性狀的試驗，將該菌分成不同的型別。見表16-1。
表16-1 蠟樣芽胞桿菌生化分型

型別	檸檬酸鹽利用	硝酸鹽還原	淀粉水解	v-p 反應	明膠液化
1	+	+	+	+	+
2	－	+	+	+	+
3	+	+	-	+	+
4	－	－	+	+	+
5	－	－	－	+	+
6	+	－	+	+	+
7	+	－	－	+	+
8	－	+	－	+	+
9	－	+	－	－	+
10	－	+	+	－	+
11	+	+	+	－	+
12	+	+	－	－	+
13	－	－	+	－	－
14	+	－	－	－	+
15	+	－	+	－	+

（五）與類似菌鑒別
本菌與其他類似菌的鑒別見表16-2。
表16-2 蠟樣芽胞桿菌與其他類似菌的鑒別

特　　　征	巨大芽胞桿菌	蠟樣芽胞桿菌	蘇云金芽胞桿菌	蕈　狀芽胞桿菌	炭疽芽胞桿菌
過氧化氫酶	+	+	+	+	+
動　　力	±	±	±	－	－
硝酸鹽還原	－	+	+	+	+
酪蛋白分解	±	+	±	±	±
卵黃反應	－	+	+	+	+
葡萄糖利用（厭氧）	－	+	+	+	+
甘露醇	+	－	－	－	－
木糖	±	－	－	－	－
溶血	－	+	+	+	±
已知致病菌特性		產生腸毒素	對昆蟲致病的內毒素結晶	假根樣生長	對動物和人致病

注：+ 90%~100%的菌株陽性；－ 90%~100%的菌株陰性；
± 大多數菌株陽性；大多數菌株陰性。
本菌在生化性狀上與蘇云金芽胞桿菌極為相似，但后者可藉細胞內產生蛋白質毒素結晶加以鑒別。其檢查方法如下：取營養瓊脂上純培養物少許，加少量蒸餾水涂于玻片上，待自然干燥后用弱火焰固定，加甲醇于玻片上，半分鐘后傾去甲醇，置火焰上干燥，然后滴加0.5%堿性復紅液，并用酒精燈加熱至微見蒸氣維持1.5min，移去酒精燈，將玻片放置半分鐘，傾去染液，置潔凈自來水充分漂洗，晾干，鏡檢。在油浸鏡下檢查有無游離芽胞和深染的似菱形的紅色結晶小體（如未形成游離芽胞，培養物應放室溫再保存1~2d后再檢查），如有即為蘇云金芽胞桿菌，蠟樣芽胞桿菌檢查為陰性。

（六）蠟樣芽胞桿菌檢驗程序

圖16-1 蠟樣芽胞桿菌檢驗程序

二、結果分析判定
（一）菌數測定
1. 蠟樣芽胞桿菌在甘露醇卵黃胞粘菌素瓊脂平板上菌落較大，因而需選取菌落數在30個左右的進行計數，超過50個以上就幾乎布滿整個平板，很難計數。
2. 蠟樣芽胞桿菌菌靈敏的計算與一般細菌計數不同，是計算蠟樣芽胞桿菌的數，其他細菌要減掉，因而要做證實試驗。
3. 蠟樣芽胞桿菌檢驗時需要計數是因為蠟樣芽胞桿菌只有菌數達到106~108個/g時，才能引起食物中毒，因而在確定食物中毒或可疑中毒食品中必需做蠟樣芽胞桿菌的計數。其次，在食品中限量檢查時，有些國家規定熟冷盤肉中10-3稀釋液不得檢出蠟樣芽胞桿菌，英國規定生凍魚和凍肉的蠟樣芽胞桿菌數每克不得超過103個。我國外貿合同中規定，對英出口熟蝦仁春卷中不得檢出蠟樣芽胞桿菌，因而在食物中毒鑒定和某些食品衛生評價中，蠟樣芽胞桿菌含量測定有著重要意義。
4. 1g檢樣中蠟樣芽胞桿菌的計算，如，將固體檢樣10-4的稀釋液0.1ml涂布于甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂平板上，生成的菌落為25個，取5個鑒定，證實為蠟樣芽胞桿菌者4個，則g檢樣中蠟樣芽胞桿菌數為：
25×4/5×104×10=2×106
式中：25——0.1ml稀釋液在平板上生成的菌落數；
4/5——取5個菌落進行鑒定，證實其中4個為蠟樣芽胞桿菌；
104——樣品的稀釋倍數
10——取0.1ml換算成1ml稀釋液的倍數。
（二）各種性狀
1. 形態染色，蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽性大桿菌，大小為1~1.3μm×3~5μm。芽胞不突出菌體，菌體兩端較平整，多數呈鏈狀排列，與炭疽芽胞桿菌相似，引起食物中毒的菌株多為周毛菌，有動力。炭疽芽胞桿菌無動力。
2. 培養特性。本菌發育溫度為25~37℃，在普通瓊脂上生成的菌落較大，直徑3~10mm，灰白色，不透明，表面粗糙。邊緣不整齊，似毛玻璃狀或融蠟狀是其特點。炭疽芽胞桿菌菌落為粗糙型卷發狀，蕈狀芽胞桿菌為假根狀，枯草芽胞桿菌菌落為干澀狀。
蠟樣芽胞桿菌在肉湯中生長混濁，微有菌膜或壁環。炭疽芽胞桿菌在肉湯內菌鏈成卷絲狀沉淀，肉湯澄清，無菌膜。
3. 動力試驗。用白金取少許培養物，由試管中心向下穿刺的方法接種于半固體普通瓊脂，于30℃培養18~24h，有動力者沿穿刺線向外伸展，無動力的細菌僅在穿刺線內和沿線生長。
大多數蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌為周毛菌是有運動的。而蕈狀芽胞桿菌和炭疽芽胞桿菌是無動力的。
4. 假根樣生長。在普通瓊脂平板上接種菌懸液，經30℃培養48~72h，檢查根樣的生成，其特征為產生帶有毛發樣或根樣結構的菌落，其根樣生長物可以從接種處向外伸展達數毫米，根樣生長是蠟樣芽胞桿菌變種覃狀芽胞桿菌的特征。
5. 卵磷脂酶和酪蛋白酶試驗。將細菌分別接種于卵黃瓊脂培養基或甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養基及酪蛋白瓊脂增基上，培養后前者生成的菌落周圍有分解卵黃出現的沉淀環，表示產生卵磷脂酶。在酪蛋白瓊脂上出出分解酪蛋白產生的透明圈。蠟樣芽胞桿菌在上兩種培基上都為明顯的陽性反應。
6. 溶血現象。蠟樣芽胞桿菌在血瓊脂培養基生成灰綠色菌落，邊緣不整，周圍有溶血圈。
7. 葡萄糖（厭氧）發酵試驗。將細菌接種于葡萄糖肉湯（表面覆蓋石蠟油），于37℃培養，一般于第七天前即發酵產酸，使培養基變黃色。
三、培養基
（一）甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂
成分：

蛋白胨	10g
牛肉膏	1g
甘露醇	10g
氯化鈉	10g
瓊脂	15g
蒸餾水	1000ml
0.2%酚紅溶液	13ml
50%卵黃液	50ml
多粘菌素B	100國際單位/ml
pH7.4

制法：將上面前五種成分加入于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH，加入酚紅溶液。分裝燒瓶，每瓶100ml。121℃高壓滅菌15min。臨用時加熱溶化瓊脂，冷至50℃，每瓶內加入50%卵黃液5ml及多粘菌素B10000國際單位，混勻后傾注平板。
（二）酪蛋白瓊脂

蛋白胨	10g
牛肉膏	3g
磷酸氫二鈉	2g
氯化鈉	5g
瓊脂	15g
蒸餾水	1000ml
0.4%溴麝香草酚藍溶液	12.5ml
pH7.4

制法：除指示劑外將各成分混合，加熱溶解（但酪蛋白不溶解），校正pH。加入指示劑，分裝燒瓶，121℃高壓滅菌15min。臨用時加熱溶化瓊脂，冷至50℃，傾注平板。
注：將菌株接種于平板上，如菌落周圍有透明圈形成，即為能水解酪蛋白。
（三）動力-硝酸鹽培養基
成分：

蛋白胨	5g
牛肉膏	3g
硝酸鉀	1g
瓊脂	3g
蒸餾水	1000ml
pH7.0

制法：加熱溶解，校正pH。分裝試管，121℃高壓滅菌15min。
（四）木糖-明膠培養基
成分：

胰胨	10g
酵母膏	10g
木糖	10g
磷酸氫二鈉	5g
明膠	120g
蒸餾水	1000ml
0.2%酚紅溶液	25ml
pH7.0

制法：除酚紅外將各成分混合，加熱溶解，校正pH。加入酚紅溶液，分裝試管，121℃高壓滅菌15min，迅速冷卻。

第二節蠟樣芽胞桿菌參考檢驗方法

一、生化分型
1985年我國吳先先生又用淀粉水解、尿素分解、V-P反應、蔗糖發酵和脫氧核糖核酸分解5項生化項目進行分型試驗，可分成32個生物型，分型率較高。
二、血清學分型
根據Taylor等（1975）研究，蠟樣芽胞桿菌可按其鞭毛抗原的不同分成1~18個血清型。Gilbert和Parry（1977）又擴大了5個血清型（23個），既或23個血清型，還有40%左右的蠟樣芽胞桿菌不能分型。目前我國尚無市售的蠟樣芽胞桿菌分型血清。

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